Kamis, 29 September 2011

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi


PENUNTUN PRAKTIKUM 

MIKROBIOLOGI

scan0007


Dosen Pengampu

Triastuti Rahayu, M.Si
Muh. Waskito Ardhi, S.Pd


FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA
2011
 

JADWAL KEGIATAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI
SEMESTER GASAL 2008/2009

Hari, Tanggal
Agenda
Jum’at, 24 Sept 2010
Asistensi Lat I
Jum’at, 1 Okt 2010
Praktek Latihan I
Jum’at, 8 Okt 2010
Asistensi Lat II
Jum’at, 15 Okt 2010
Praktek Lat II
Jum’at, 22 Okt 2010
Asistensi Lat III
Jum’at, 29 Okt 2010
Praktek Lat III
Jum’at, 19 Nop 2010
Asistensi Lat IV
Jum’at, 26 Nop 2010
Praktek Lat IV
Jum’at, 3 Des 2010
Asistensi Lat V
Jum’at, 10 Des 2010
Praktek Lat V
Jum’at, 17 Des 2010
Asistensi Lat VI
Jum’at, 24 Des 2010
Praktek Lat VI
Jum’at, 31 Des 2010
Responsi

Lat I         : Sterilisasi Alat
Lat II        : Pembuatan Media
Lat III       : Pertumbuhan  Mikrobia
Lat IV      : Isolasi Mikrobia
Lat V       : Morfologi Khamir dan Kapang
Lat VI      : Fermentasi
                        

Tata Tertib Praktikum Mikrobiologi

1.       Sebelum praktikum, semua praktikan wajib mengikuti asistensi dan pretest sesuai dengan bahan yang akan dipraktikumkan.
2.       Pakaian : pakaian muslim (bukan baju “ADIK”),  atasan tidak boleh dari bahan kaos, bawahan tidak boleh berbahan jeans,  sepatu tertutup
3.       Semua praktikan diwajibkan mengenakan kelengkapan pakaian praktikum (jas lab)  dan identitas selama melaksanakan kegiatan di laboratorium.
4.       Keterlambatan lebih dari 15 menit tanpa alasan yang dapat diterima, mahasiswa harus mengikuti praktikum pada gelombang terakhir dengan ijin Dosen Pengampu Praktikum.
5.       Tidak diadakan praktikum susulan.
6.       Praktikan wajib mengikuti praktikum minimal 5 latihan, bila dua kali latihan tidak mengikuti tanpa keterangan atau alasan yang syah, mahasiswa dianggap mengundurkan diri.
7.       Semua peralatan laboratorium menjadi tanggung jawab praktikan, setelah selesai wajib dikembalikan dalam kondisi utuh, rapi dan bersih.
8.       Kerusakan atau kehilangan alat menjadi tanggung jawab kelompok, dan wajib mengganti sama seperti alat yang dimaksud.
9.       Setiap selesai acara praktikum wajib membuat laporan sementara dan minta pengesahan dosen atau asisten kemudian dilampirkan dalam laporan resmi yang dibuat perorangan.
10.    Pada akhir kegiatan praktikum semua praktikum wajib mengikuti ujian responsi.

Pengampu Praktikum Mikrobiologi
                          Team
LATIHAN I & II
STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIA

A.   Landasan Teori
Sterilisasi adalah usaha untuk membebaskan alat dan bahan dari segala bentuk kehidupan terutama mikrobia. Suatu alat/bahan dikatakan steril apabila alat/bahan tersebut bebas dari mikrobia, baik dalam bentuk vegetatif maupun spora.
Terdapat berbagai cara sterilisasi yang dikenal dan pemilihannya tergantung dari jenis dan sifat alat/bahan yang akan disterilisasi (ketahanan terhadap panas; bentuk bahan yang diterilkan : cair, padat atau gas).
Cara-cara sterilisasi :
  1. Pemanasan ; tujuannya untuk merusak atau membunuh mikrobia
a.       Pemanasan kering : membakar (pemijaran), oven
b.       Panas basah : merebus, uap air panas, uap air panas bertekanan (autoklaf) , pasteurisasi
  1. Filtrasi; tujuannya untuk membebaskan media cair yang tidak tahan panas dari mikrobia
  2. Penyinaran menggunakan sinar gelombang pendek (Radiasi)
  3. Cara kimia

Pemanasan kering – Membakar -
Cara ini dapat digunakan untuk sterilisasi alat-alat yang berupa logam (ose, pinset), gelas (ujung pipet, bibir tabung, bibir Erlenmeyer). Untuk mensterilkan ose dilakukan dengan membakar ose pada nyala api lampu spiritus dan dimulai dari pangkal kawat secara perlahan dilanjutkan ke ujung ose. Ini dilakukan untuk mencegah terloncatnya sisa mikrobia akibat pemanasan langsung dan terlalu cepat pada mata ose.

Pemanasan kering – oven –
Digunakan untuk sterilisasi alat-alat laboratorium dari gelas seperti : petri, tabung gelas, bahan berbentuk powder (talk). Biasanya untuk sterilisasi digunakan panas dengan suhu 175oC selama 1,5-2 jam. 

Panas Basah – Autoklaf –
Autoklaf adalah alat yang terdiri dari bejana tahan tekanan tinggi yang dilengkapi manometer, termometer dan klep bahaya. Langkah-langkah penggunaan autoklaf adalah sebagai berikut : Alat dan bahan yang akan disterilkan dimasukkan ke bejana autoklaf (alat dibungkus kertas payung atau disumbat kapas, media dimasukkan ke dalam erlenmeyer/tabung reaksi kemudian ditutup kapas).  Autoklaf dihubungkan dengan sumber listrik. Katup pengeluaran uap dibuka. Setelah kurang lebih 10 – 15 menit, katup ditutup. Temperatur dan tekanan dibiarkan naik sampai 121oC dengan tekanan 2 atm selama 15 – 30 menit. Apabila sterilisasi telas selesai, autoklaf dibiarkan dingin sampai tekanan menunjukkan angka nol baru dibuka.

B.  Tujuan             :
  1. Mengetahui cara-cara sterilisasi alat dan bahan
  2. Mengetahui cara-cara pembuatan media untuk menumbuhkan mikroorganisme

C.  Alat dan Bahan              :
  1. Kentang 170 g, panci, kompor, agar-agar 7 g, akuades 250 mL, 1 kubus kaldu sapi
  2. Petridish, tabung reaksi steril, kapas, timbangan, kertas payung, karet, autoklaf, öse, lampu bunsen, erlenmeyer 100 ml, alumunium foil.



D. Cara Kerja       :
D.1. Sterilisasi alat
  1. Petridisk dibungkus kertas payung, tabung reaksi dan erlenmeyer disumbat menggunakan kapas.
  2. Melakukan pengecekan air pada autoklaf, apabila kurang ditambahkan air sampai batas.
  3. Memasukkan alat-alat yang sudah disiapkan ke dalam bejana autoklaf.
  4. Sterilisasi alat menggunakan autoklaf selama 20 – 30 menit.

D.2. Pembuatan Medium untuk menumbuhkan bakteri
  1. Kupas kentang dan potong menjadi potongan-potongan kecil
  2. Masukkan potongan-potongan kentang ke dalam panci dan tambahkan 500 mL air
  3. Letakkan panci di atas kompor dan didihkan potongan kentang sampai benar-benar matang. Tiriskan dan simpan cairan kentangnya
  4. Taburkan agar-agar ke dalam 250 mL akuades dan kaldu sapi ke cairan kentang dalam panci
  5. Panaskan dengan panas sedang, aduk terus, sampai kaldu dan agar-agar larut
  6. Tuangkan campuran di atas ke dalam tabung-tabung erlenmeyer
  7. Sterilkan dengan autoklaf pada tekanan 2 atm (suhu 121oC) selama 15 menit.
  8. Untuk medium agar miring, setelah sterilisasi diletakkan miring 30oC terhadap bidang datar dan biarkan menjadi padat.
  9. Sebagian medium dituang ke dalam petridish steril (± 15 ml).
  10. Biarkan sampai dingin dan padat (digunakan untuk latihan III).



LATIHAN III  &  IV
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI MIKROBIA


A.    Landasan Teori

I. Isolasi
Mengisolasi suatu mikrobia adalah memisahkan mikrobia tersebut dari lingkungannya di alam dan menumbuhkannya sebagai biakan murni dalam medium buatan. Untuk isolasi harus diketahui cara-cara menginokulasi dan menumbuhkan mikrobia pada medium biakan serta syarat-syarat lain untuk pertumbuhannya.
Untuk menanam suatu mikrobia harus diperhatikan faktor nutrisi dan kebutuhan O2-nya. Ada beberapa cara penanaman mikrobia aerob. Berdasarkan bentuk medium dan cara menanamnya dapat dibedakan :
  1. Biakan agar tegak (agar deep culture)
  2. Biakan agar miring (agar slant culture)
  3. Biakan cair (broth culture)
Ada beberapa cara untuk isolasi mikrobia. Untuk isolasi tersebut harus diperhatikan beberapa hal penting, antara lain :
  1. Sifat-sifat spesies mikrobia yang akan diisolasi
  2. Tempat hidup atau asal mikrobia
  3. Medium pertumbuhan yang sesuai
  4. Cara menanam mikrobia
  5. Cara menguji bahwa mikrobia yang diisolasi telah berupa biakan murni
  6. Cara memelihara agar mikrobia yang telah diisolasi tetap merupakan biakan murni.


Ada tiga cara yang umum digunakan untuk mengisolasi bakteri yaitu :
  1. Cara Goresan (streak plate method): yaitu dengan menggoreskan suspensi bahan yang mengandung bakteri pada permukaan medium agar dalam petridish. Setelah inkubasi maka pada bekas goresan akan tumbuh koloni-koloni terpisah.
  2. Cara Taburan (Pour plate method) : yaitu menginokulasi medium agar yang sedang mencair pada temperatur 50oC dengan suspensi bahan yang mengandung bakteri dan menuangkannya ke dalam petridish steril. Setelah inkubasi akan terlihat koloni-koloni yang tersebar di permukaan agar.
  3. Cara Tebaran (Spread Plate method) : seperti cara taburan tetapi sampel ditebar dalam permukaan medium yang padat dalam petridish menggunakan drigalski.

II. Identifikasi Mikrobia

Sebagian hasil eksperimen genetik bakteri  mempunyai morfologi individu sel, kelompok sel dan koloni yang menciri bagi spesimen atau genus bakteri. Oleh karena itu, morfologi bakteri dapat digunakan sebagai salah satu pedoman dalam identifikasi bakteri.
A).   Struktur dan Morfologi Bakteri


http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/6/69/Bacterial_morphology_diagram.svg/300px-Bacterial_morphology_diagram.svg.png
 

magnify-clip







Bakteri memiliki bentuk yang sangat bervariasi, bentuk sel bakteri meliputi:
  1. kokus (bulat)
  2. basil (batang)
  3. spirilum (spiral)
Bentuk sel menunjukkan karakteristik spesies bakteri tersebut, tetapi dapat bervariasi tergantung kondisi pertumbuhannya. Beberapa bakteri memiliki siklus hidup yang kompleks.

Ukuran sel

Ukuran bakteri sangat kecil berkisar antara 0,5-5μm. Bakteri terbesar yang pernah ditemukan adalah Thiomargarita dengan lebar mencapai 750μm (0,75 mm) yang membuatnya bisa terlihat dengan mata telanjang.

Dinding sel

Fungsi dinding sel pada prokaryota, adalah melindungi sel dari tekanan turgor yang disebabkan tingginya konsentrasi protein dan molekul lainnya dalam tubuh sel dibandingkan dengan lingkungan di luarnya. Dinding sel bakteri berbeda dari organisme lain. Dinding sel bakteri mengandung peptidoglikan yang terletak di luar membran sitoplasmik. Peptidoglikan berperan dalam kekerasan dan memberikan bentuk sel. Ada dua tipe utama bakteri berdasarkan kandungan peptidoglikan dinding selnya yaitu Gram positif dan Gram negatif.

a.     Dinding sel Gram positif

Karakteristik utamanya adalah tebalnya lapisan peptidoglikan pada dinding sel. Akibatnya, pada saat prosedur pewarnaan Gram, meninggalkan warna biru. Dinding sel Gram positif biasa ditemukan pada Actinobacteria dan Firmicutes.

b.    Dinding sel Gram negatif

Tidak seperti dinding sel Gram positif, dinding sel Gram negatif memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis. Hal ini menyebabkan lunturnya warna biru saat disiram etanol.
B).   Struktur permukaan bakteri lainnya

a.     Pili dan fimbria

Fimbria adalah tabung protein yang menonjol dari membran pada banyak spesies dari Proteobacteria. Fimbria umumnya pendek dan terdapat banyak di seluruh permukaan sel bakteri. Struktur pili mirip dengan fimbria dan ada di permukaan sel bakteri namun tidak banyak. Pili berperan dalam konjugasi bakteri.

b.    Kapsul dan lapisan lendir

Kapsul adalah bagian asesori dari bakteri berfungsi melindungi bakteri dari suhu atau kondisi lingkungan yang ekstrim

c.     Flagela



http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/0/08/Flagella.png/200px-Flagella.png
 

magnify-clip











Flagela adalah struktur kompleks yang tersusun atas bermacam-macam protein termasuk flagelin yang membuat flagela berbentuk seperti tabung cambuk dan protein kompleks yang memanjangkan dinding sel dan membran sel untuk membentuk motor yang menyebabkan flagela berotasi. Flagela berbentuk seperti cambuk. Flagela digunakan bakteri sebagai alat gerak. Bentuk yang umum dijumpai meliputi:
  • Monotrik - Flagela tunggal ditemukan di satu tempat di sekitar sel
  • Peritrik - Banyak flagela ditemukan di beberapa tempat di sekitar sel
  • Amfitrik - Banyak flagela ditemukan pada kedua kutub sel
  • Lofotrik - Flagela ditemukan pada salah satu kutub sel

d.    Struktur sel bakteri bagian dalam

Dibandingkan dengan eukaryota, bagian dalam sel bakteri sangat sederhana.

Kromosom dan plasmid


http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/9/99/Prokaryote_cell_diagram.svg/290px-Prokaryote_cell_diagram.svg.png











e.     Struktur sel prokaryota

Tidak seperti eukaryota, kromosom bakteri tidak dikelilingi membran-bound nucleus melainkan ada di dalam sitoplasma sel bakteri. Ini berarti translasi, transkripsi dan replikasi DNA semuanya terjadi di tempat yang sama dan dapat berinteraksi dengan struktur sitoplasma lainnya, salah satunya ribosom.

f.     Membran intraselular

Membran intraselular dapat ditemui pada bakteri fototrof, bakteri nitrifying dan bakteri metana.

g.    Ribosom

Semua prokaryota memiliki 70S (di mana S = satuan Svedberg) ribosom sedangkan eukaryota memiliki 80S ribosom pada sitosol mereka.

h.     Vakuola gas

Dengan mengatur jumlah gas dalam vakuola gasnya, bakteri dapat meningkatkan atau mengurangi kepadatan sel mereka secara keseluruhan dan bergerak ke atas atau bawah dalam air.

i.      Endospora

Endospora tahan terhadap berbagai jenis larutan kimia, dan keadaan lingkungan yang tidak baik.
B.  Tujuan         :
  1. Mengisolasi bakteri dari sample material vulkanik Gunung Merapi dengan Cara Goresan (streak plate method)
2.  Mengisolasi bakteri dari material vulkanik Gunung Merapi dengan Cara Tebaran (Spread Plate method)
3.   Mengidentifikasi bakteri dari material vulkanik Gunung Merapi

C.  Alat dan Bahan Isolasi Mikrobia :
  1. Bahan : Material vulkanik Gunung Merapi,  medium pertumbuhan bakteri,  akuades steril.
  2. Alat : Petridish steril, tabung reaksi steril,  öse, drigalski, pembakar spiritus, erlenmeyer 100 ml steril, spet 1 ml, mikroskop, gelas benda dan penutup, ayakan tepung, gelas ukur steril.
  3. Alat dan Bahan untuk Identifikasi mikrobia  : Medium agar miring, öse, lampu bunsen, akuades, pipet tetes, mikroskop, gelas benda dan penutup, Gram A, B, C, D, tisue

D. Cara Kerja    :
D.1. Pengenceran sample (misalnya tanah).
1.     Ayaklah Material vulkanik Gunung Merapi sehingga diperoleh butiran materila yang seragam.
2.     Timbang 1 gram sampel  yang sudah diayak.
3.     Masukkan 1 gram sampel tersebut secara aseptik dalam 99 ml akuades steril (pengenceran 1:100) selanjutnya kocok baik-baik supaya bakteri tersuspensi homogen. Pengenceran ini merupakan pengenceran 10-2.
4.     Buatlah pengenceran berseri sampai pengenceran 10-4.

D.2.  Isolasi Mikrobia Cara Goresan

  1. Cairkan nutrien-agar dalam penangas air
  2. Dinginkan sampai temperatur sekitar  50oC
  3. Tuangkan medium tersebut ke dalam petridish steril secara aseptik, biarkan sampai dingin dan padat.
  4. Ambil 1 öse suspensi sampel dari pengenceran 10-4 secara aseptik, kemudian buat goresan pada permukaan agar (pada permulaan goresan akan terjadi pertumbuhan bakteri yang lebat sehingga sukar untuk diisolasi. Pada akhir goresan biasanya tumbuh koloni yang terpisah-pisah dan dapat diisolasi.
  5. Balikkan petridish yang telah diberi label dan bungkus kembali. Inkubasikan pada suhu 37oC selama 24 jam
  6. Setelah inkubasi akan tampak koloni yang terpisah-pisah. Tiap koloni yang terpisah mungkin berasal dari satu sel bakteri.
  7. Pilih dari masing-masing tipe koloni satu koloni saja kemudian secara aseptik dengan öse diambil satu koloni yang selanjutnya pindahkan ke medium nutrien-agar miring.
  8. Inkubasikan pada suhu 37oC selama 24 jam
  9. Periksalah dengan pengecatan Gram
D.3.  Isolasi Mikrobia Cara Teburan      :
  1. Cairkan nutrien agar dalam penangas air
  2. Tuangkan medium tersebut ke dalam petridish steril secara aseptik, biarkan sampai dingin dan padat.
  3. Ambil larutan sampel pada pengenceran 10-4 sebanyak 0,1 mL menggunakan spet steril kemudian tebar di permukaan agar menggunakan drigalski. 
  4. Beri label dan bungkus kembali, selanjutnya sama dengan cara (D.2:5 – 9)
D.4. Cara Pengecatan Gram
Cara pengecatan Gram :
1.       Bersihkan gelas benda dengan alkohol kemudian panggang di atas lampu spiritus sampai kering
2.       Ambil secara aseptik 1 öse suspensi bakteri dan letakkan pada gelas benda. Ratakan suspensi bakteri tersebut.
3.       Keringanginkan dan selanjutnya fiksasi di atas nyala lampu spiritus
4.       Setelah dingin bubuhkan cat utama (Gram A) sebanyak 2 – 3 tetes dan diamkan selama 1 menit.
5.       Cuci dengan air mengalir kemudian keringanginkan
6.       Tetesi dengan Mordan (Gram B) dan biarkan selama 1 menit, cuci dengan air mengalir dan keringanginkan.
7.       Cuci dengan cat peluntur (Gram C) selama lk 30 detik selanjutnya cuci dengan air mengalir dan keringanginkan.
8.       Tetesi dengan larutan air fuksin (Gram D) selama 1 menit selanjutnya cuci dengan air mengalir dan keringanginkan.
9.       Amati preparat di bawah mikroskop. Amati warna dan gambar bentuk sel ! Tentukan sifat Gram dari bakteri tersebut! (Gram positif warna Ungu sedang Gram negatif warna merah).